Den mobile fasen tilsvarer væskefasen av blod, og det er forskjellige ting å være oppmerksom på under bruk. Blant dem er det noen "fallgruver" som må tas hensyn til.
01. Mål pH i den mobile fasen etter tilsetning av organisk løsningsmiddel
Måler du pH med et organisk tilsetningsstoff, vil pH du får være annerledes enn før du tilsetter det organiske løsningsmidlet. Det viktigste er imidlertid å være konsekvent. Hvis du alltid måler pH etter tilsetning av det organiske løsningsmidlet, sørg for å angi trinnene dine i metoden du bruker, slik at andre følger samme metode. Denne metoden er ikke 100% nøyaktig, men den vil i det minste holde metoden konsistent. Dette kan være viktigere enn å få en nøyaktig pH-verdi.
02. Ingen buffer brukt
Formålet med en buffer er å kontrollere pH og forhindre at den endres. Mange andre metoder endrer pH i mobilfasen, noe som kan forårsake endringer i retensjonstid, toppform og topprespons.
Maursyre, TFA osv. er ikke buffere
03. Bruker ikke buffer innenfor det normale pH-området
Hver buffer har en rekkevidde på 2 pH-enheter, innenfor hvilken den gir den beste pH-stabiliteten. Buffere utenfor dette vinduet vil ikke gi effektiv motstand mot pH-endringer. Bruk enten en buffer i riktig område, eller velg en buffer som dekker pH-området du trenger.
04. Tilsett buffer til organisk løsning
Blanding av en bufferløsning med en organisk fase vil mest sannsynlig føre til at bufferen utfelles. I mange tilfeller, selv om det har kommet nedbør, er det fortsatt vanskelig å oppdage. Husk å alltid tilsette den organiske løsningen til den vandige fasen, noe som i stor grad kan redusere sjansen for bufferutfelling.
05. Bland konsentrasjonsgradienten fra 0 % med en pumpe
Pumper som er tilgjengelige i dag kan effektivt blande mobile faser og avgasse inline, men ikke alle som bruker metoden din vil ha en pumpe av høy kvalitet. Bland A og B til en enkelt løsning og kjør den 100 % inline.
For eksempel kan 950 ml organisk utgangsblanding fremstilles ved å blande med 50 ml vann. Fordelen med dette er at det kan redusere variasjonen mellom HPLC-er og redusere muligheten for bobler og nedbør i systemet. Det er verdt å merke seg at forholdet mellom pumpeblandingen er 95:5, noe som ikke betyr at den ferdigblandede oppbevaringstiden i flasken også er 95:5.
06. Bruker ikke riktig modifisert syre (base) for å bytte buffer
Bruk kun syren eller basen som danner buffersaltet du bruker. For eksempel bør en natriumfosfatbuffer tilberedes med bare fosforsyre eller natriumhydroksid.
07. Ikke oppgi all informasjon om bufferen i metoden, for eksempel å legge til 5g avnatriumfosfat til 1000 ml vann.
Buffertypen bestemmer pH-området som kan bufres. Den nødvendige konsentrasjonen bestemmer bufferstyrken. 5 gram eller vannfritt natriumfosfat og 5 gram mononatriumfosfatmonohydrat har forskjellige bufferstyrker.
08. Tilsetting av organiske løsemidler før kontroll
Hvis den forrige metoden brukte en bufferløsning for baseline B, og metoden din bruker en organisk løsning for baseline B, kan du forhåpentligvis sette bufferen i pumpeslangen og pumpehodet.
09. Løft flasken og tøm den siste dråpen
Det er en god sjanse for at du ikke har nok mobilfase til å fullføre hele løpeturen og prøven din vil ryke. Foruten muligheten for å brenne ut pumpesystemet og kolonnen, vil den mobile fasen fordampe fullstendig og den mobile fasen på toppen av flasken endres.
10. Bruk ultrasonisk avgassing mobil fase
Det viktigste punktet er å sørge for at alle buffersaltene er oppløst, men dette er den verste måten å avgasse på og vil raskt varme opp den mobile fasen, noe som får de organiske komponentene til å fordampe. For å spare unødvendig trøbbel senere, bruk fem minutter på å vakuumfiltrere mobilfasen din.
Innleggstid: 27. august 2024