Væskekromatografi er hovedmetoden for å teste innholdet av hver komponent og urenheter i råvarer, mellomprodukter, preparater og emballasjematerialer, men mange stoffer har ikke standardmetoder å stole på, så det er uunngåelig å utvikle nye metoder. I utviklingen av væskefasemetoder er den kromatografiske kolonnen kjernen i væskekromatografi, så hvordan velge en passende kromatografisk kolonne er avgjørende. I denne artikkelen vil forfatteren forklare hvordan man velger en væskekromatografikolonne fra tre aspekter: generelle ideer, betraktninger og anvendelsesomfang.
A. Overordnede ideer for valg av væskekromatografikolonner
1. Vurder analyttens fysiske og kjemiske egenskaper: som kjemisk struktur, løselighet, stabilitet (som om det er lett å bli oksidert/redusert/hydrolysert), surhet og alkalitet osv., spesielt den kjemiske strukturen er nøkkelen. faktor for å bestemme egenskapene, slik som den konjugerte gruppen har sterk ultrafiolett absorpsjon og sterk fluorescens;
2. Bestem formålet med analysen: om høy separasjon, høy kolonneeffektivitet, kort analysetid, høy følsomhet, høytrykksmotstand, lang kolonnelevetid, lave kostnader osv. er nødvendig;
- Velg en passende kromatografisk kolonne: forstå sammensetningen, fysiske og kjemiske egenskaper til det kromatografiske fyllstoffet, som partikkelstørrelse, porestørrelse, temperaturtoleranse, pH-toleranse, adsorpsjon av analytten, etc.
- Betraktninger for valg av væskekromatografikolonner
Dette kapittelet vil diskutere faktorene som skal vurderes ved valg av en kromatografikolonne fra perspektivet av de fysiske og kjemiske egenskapene til selve kromatografikolonnen. 2.1 Fyllmatrise
2.1.1 Silikagelmatrise Fyllstoffmatrisen i de fleste væskekromatografikolonner er silikagel. Denne typen fyllstoff har høy renhet, lav pris, høy mekanisk styrke og er lett å modifisere grupper (som fenylbinding, aminobinding, cyanobinding, etc.), men pH-verdien og temperaturområdet den tåler er begrenset: pH-området for de fleste silikagelmatrisefyllstoffer er 2 til 8, men pH-området til spesielt modifiserte silikagelbundne faser kan være så bredt som 1,5 til 10, og det er også spesialmodifiserte silikagelbundne faser som er stabile ved lav pH, slik som Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, som er stabil ved pH 1 til 8; den øvre temperaturgrensen for silikagelmatrisen er vanligvis 60 ℃, og noen kromatografikolonner kan tolerere en temperatur på 40 ℃ ved høy pH.
2.1.2 Polymermatrise Polymerfyllstoffer er for det meste polystyren-divinylbenzen eller polymetakrylat. Fordelene deres er at de tåler et bredt pH-område – de kan brukes i området 1 til 14, og de er mer motstandsdyktige mot høye temperaturer (kan nå over 80 °C). Sammenlignet med silikabaserte C18 fyllstoffer har denne typen fyllstoffer sterkere hydrofobicitet, og den makroporøse polymeren er svært effektiv til å separere prøver som proteiner. Ulempene er at kolonneeffektiviteten er lavere og den mekaniske styrken er svakere enn for silikabaserte fyllstoffer. 2.2 Partikkelform
De fleste moderne HPLC-fyllstoffer er sfæriske partikler, men noen ganger er de uregelmessige partikler. Sfæriske partikler kan gi lavere kolonnetrykk, høyere kolonneeffektivitet, stabilitet og lengre levetid; ved bruk av høyviskose mobile faser (som fosforsyre) eller når prøveløsningen er tyktflytende, har uregelmessige partikler et større spesifikt overflateareal, noe som er mer gunstig for den fulle virkningen av de to fasene, og prisen er relativt lav. 2.3 Partikkelstørrelse
Jo mindre partikkelstørrelse, jo høyere kolonneeffektivitet og høyere separasjon, men jo dårligere er høytrykksmotstanden. Den mest brukte kolonnen er 5 μm partikkelstørrelseskolonnen; hvis separasjonskravet er høyt, kan et 1,5-3 μm fyllstoff velges, noe som bidrar til å løse separasjonsproblemet til noen komplekse matrise- og flerkomponentprøver. UPLC kan bruke 1,5 μm fyllstoffer; Fyllstoffer på 10 μm eller større partikkelstørrelse brukes ofte til semi-preparative eller preparative kolonner. 2.4 Karboninnhold
Karboninnhold refererer til andelen bundet fase på overflaten av silikagel, som er relatert til spesifikt overflateareal og bundet fasedekning. Høyt karboninnhold gir høy kolonnekapasitet og høy oppløsning, og brukes ofte til komplekse prøver som krever høy separasjon, men på grunn av den lange interaksjonstiden mellom de to fasene er analysetiden lang; kromatografiske kolonner med lavt karboninnhold har kortere analysetid og kan vise ulik selektivitet, og brukes ofte til enkle prøver som krever rask analyse og prøver som krever høye vannfaseforhold. Generelt varierer karboninnholdet til C18 fra 7 % til 19 %. 2.5 Porestørrelse og spesifikt overflateareal
HPLC-adsorpsjonsmedier er porøse partikler, og de fleste interaksjoner finner sted i porene. Derfor må molekyler inn i porene for å bli adsorbert og separert.
Porestørrelse og spesifikt overflateareal er to komplementære konsepter. Liten porestørrelse betyr stort spesifikt overflateareal, og omvendt. Et stort spesifikt overflateareal kan øke interaksjonen mellom prøvemolekyler og bundne faser, forbedre retensjon, øke prøvebelastning og kolonnekapasitet, og separasjon av komplekse komponenter. Fullporøse fyllstoffer tilhører denne typen fyllstoffer. For de med høye separasjonskrav anbefales det å velge fyllstoffer med stort spesifikt overflateareal; lite spesifikt overflateareal kan redusere mottrykket, forbedre kolonneeffektiviteten og redusere likevektstiden, som er egnet for gradientanalyse. Kjerne-skall fyllstoffer tilhører denne typen fyllstoffer. Ut fra forutsetningen om å sikre separasjon, anbefales det å velge fyllstoffer med lite spesifikt overflateareal for de med høye krav til analyseeffektivitet. 2.6 Porevolum og mekanisk styrke
Porevolum, også kjent som "porevolum", refererer til størrelsen på tomromsvolumet per partikkelenhet. Det kan godt gjenspeile den mekaniske styrken til fyllstoffet. Den mekaniske styrken til fyllstoffer med stort porevolum er litt svakere enn fyllstoffer med lite porevolum. Fyllstoffer med porevolum mindre enn eller lik 1,5 mL/g brukes mest til HPLC-separasjon, mens fyllstoffer med porevolum større enn 1,5 mL/g hovedsakelig brukes til molekylær eksklusjonskromatografi og lavtrykkskromatografi. 2.7 Begrensningsgrad
Kapping kan redusere haletoppene forårsaket av interaksjonen mellom forbindelser og eksponerte silanolgrupper (som ionisk binding mellom alkaliske forbindelser og silanolgrupper, van der Waals-krefter og hydrogenbindinger mellom sure forbindelser og silanolgrupper), og derved forbedre kolonneeffektiviteten og toppformen . Uavsluttede bundne faser vil produsere forskjellige selektiviteter i forhold til avdekkede bundne faser, spesielt for polare prøver.
- Anvendelsesomfang for forskjellige væskekromatografikolonner
Dette kapittelet vil beskrive bruksomfanget til forskjellige typer væskekromatografikolonner gjennom noen tilfeller.
3.1 Revers-fase C18 kromatografikolonne
C18-kolonnen er den mest brukte revers-fase-kolonnen, som kan oppfylle innholds- og urenhetstestene til de fleste organiske stoffer, og kan brukes på middels-polare, svakt polare og ikke-polare stoffer. Type og spesifikasjon av C18 kromatografikolonne bør velges i henhold til de spesifikke separasjonskravene. For stoffer med høye separasjonskrav brukes for eksempel ofte 5 μm*4,6 mm*250 mm spesifikasjoner; for stoffer med komplekse separasjonsmatriser og lignende polaritet kan 4 μm*4,6 mm*250 mm spesifikasjoner eller mindre partikkelstørrelser brukes. For eksempel brukte forfatteren en 3 μm*4,6 mm*250 mm kolonne for å oppdage to genotoksiske urenheter i celecoxib API. Separasjonen av de to stoffene kan nå 2,9, noe som er utmerket. I tillegg, under forutsetningen om å sikre separasjon, hvis rask analyse er nødvendig, velges ofte en kort kolonne på 10 mm eller 15 mm. For eksempel, når forfatteren brukte LC-MS/MS for å påvise en genotoksisk urenhet i piperaquin phosphate API, ble det brukt en 3 μm*2,1 mm*100 mm kolonne. Separasjonen mellom urenheten og hovedkomponenten var 2,0, og påvisningen av en prøve kan fullføres på 5 minutter. 3.2 Omvendt-fase fenylkolonne
Fenylkolonne er også en type omvendt fasekolonne. Denne typen kolonne har sterk selektivitet for aromatiske forbindelser. Hvis responsen til aromatiske forbindelser målt med vanlig C18-kolonne er svak, kan du vurdere å erstatte fenylkolonnen. For eksempel, da jeg laget celecoxib API, var hovedkomponentresponsen målt av fenylkolonnen til samme produsent og samme spesifikasjon (alle 5 μm*4,6 mm*250 mm) omtrent 7 ganger den for C18-kolonnen. 3.3 Normalfase kolonne
Som et effektivt supplement til revers-fase kolonne, er normal-fase kolonne egnet for svært polare forbindelser. Hvis toppen fortsatt er veldig rask ved eluering med mer enn 90 % vannfase i reversfasekolonnen, og til og med nær og overlapper med løsemiddeltoppen, kan du vurdere å erstatte normalfasekolonnen. Denne typen kolonne inkluderer hilic kolonne, amino kolonne, cyano kolonne, etc.
3.3.1 Hilisk søyle Hilisk søyle legger vanligvis inn hydrofile grupper i den bundne alkylkjeden for å øke responsen på polare stoffer. Denne typen kolonne er egnet for analyse av sukkerstoffer. Forfatteren brukte denne typen kolonner når han gjorde innholdet og relaterte stoffer av xylose og dets derivater. Isomerene av et xylosederivat kan også være godt separert;
3.3.2 Aminokolonne og cyanokolonne Aminokolonne og cyanokolonne refererer til introduksjonen av henholdsvis amino- og cyanomodifikasjoner på slutten av den bundne alkylkjeden, for å forbedre selektiviteten for spesielle stoffer: for eksempel er aminokolonne et godt valg for separering av sukker, aminosyrer, baser og amider; cyanokolonne har bedre selektivitet ved separering av hydrogenerte og uhydrogenerte strukturelle lignende stoffer på grunn av tilstedeværelsen av konjugerte bindinger. Aminokolonne og cyanokolonne kan ofte byttes mellom normalfasekolonne og reversfasekolonne, men hyppig veksling anbefales ikke. 3.4 Kiral kolonne
Kiral kolonne, som navnet antyder, er egnet for separasjon og analyse av kirale forbindelser, spesielt innen farmasøytiske produkter. Denne typen kolonne kan vurderes når konvensjonelle reversfase- og normalfasekolonner ikke kan oppnå separasjon av isomerer. For eksempel brukte forfatteren en 5 μm*4,6 mm*250 mm kiral kolonne for å skille de to isomerene av 1,2-difenyletylendiamin: (1S, 2S)-1, 2-difenyletylendiamin og (1R, 2R)-1, 2 -difenyletylendiamin, og separasjonen mellom de to nådde ca. 2,0. Chirale søyler er imidlertid dyrere enn andre typer søyler, vanligvis 1W+/stk. Dersom det er behov for slike kolonner, må enheten lage et tilstrekkelig budsjett. 3.5 Ionebytterkolonne
Ionebytterkolonner er egnet for separasjon og analyse av ladede ioner, slik som ioner, proteiner, nukleinsyrer og noen sukkerstoffer. I henhold til fyllstofftypen er de delt inn i kationbytterkolonner, anionbytterkolonner og sterke kationbytterkolonner.
Kationbytterkolonner inkluderer kalsiumbaserte og hydrogenbaserte kolonner, som hovedsakelig er egnet for analyse av kationiske stoffer som aminosyrer. For eksempel brukte forfatteren kalsiumbaserte kolonner når han analyserte kalsiumglukonat og kalsiumacetat i en spyleløsning. Begge stoffene hadde sterke responser ved λ=210nm, og separasjonsgraden nådde 3,0; forfatteren brukte hydrogenbaserte kolonner ved analyse av glukoserelaterte stoffer. Flere viktige relaterte stoffer – maltose, maltotriose og fruktose – hadde høy sensitivitet under differensialdetektorer, med en deteksjonsgrense så lav som 0,5 ppm og en separasjonsgrad på 2,0-2,5.
Anionbytterkolonner er hovedsakelig egnet for analyse av anioniske stoffer som organiske syrer og halogenioner; Sterke kationbytterkolonner har høyere ionebytterkapasitet og selektivitet, og er egnet for separasjon og analyse av komplekse prøver.
Ovenstående er bare en introduksjon til typene og bruksområdene til flere vanlige væskekromatografikolonner kombinert med forfatterens egen erfaring. Det er andre spesielle typer kromatografiske kolonner i faktiske applikasjoner, for eksempel kromatografiske kolonner med store porer, kromatografiske kolonner med små porer, affinitetskromatografikolonner, multimodus-kromatografikolonner, ultrahøyytelses væskekromatografikolonner (UHPLC), kolonner med superkritisk væskekromatografi ( SFC), etc. De spiller en viktig rolle på forskjellige felt. Den spesifikke typen kromatografisk kolonne bør velges i henhold til strukturen og egenskapene til prøven, separasjonskrav og andre formål.
Innleggstid: 14. juni 2024