Prinsipper og metoder for kvantitativ analyse ved væskekromatografi

Separasjonsmekanismen for væskekromatografi er basert på forskjellen i affiniteten til komponentene i blandingen for de to fasene.

I henhold til de forskjellige stasjonære fasene er væskekromatografi delt inn i væske-faststoffkromatografi, væske-væskekromatografi og bundet fasekromatografi.De mest brukte er væske-faststoffkromatografi med silikagel som fyllstoff og bundetfasekromatografi med mikrosilika som matrise.

I henhold til formen for stasjonær fase kan væskekromatografi deles inn i kolonnekromatografi, papirkromatografi og tynnsjiktskromatografi.I henhold til adsorpsjonskapasiteten kan den deles inn i adsorpsjonskromatografi, partisjonskromatografi, ionebytterkromatografi og gelpermeasjonskromatografi.

De siste årene har et høytrykks væskestrømsystem blitt lagt til væskekolonnekromatografisystemet for å få mobilfasen til å strømme raskt under høyt trykk for å forbedre separasjonseffekten, så høyeffektiv (også kjent som høytrykk) væskekromatografi har dukket opp.

DEL
01 Prinsippet for kvantitativ analyse av væskekromatografi

For å kvantifisere på grunnlag av kvalitative, kreves rene stoffer som standarder;

Kvantifisering av væskekromatografi er en relativt kvantitativ metode: det vil si at mengden av analytten i blandingen estimeres fra en kjent mengde ren standardprøve

DEL
02 Grunnlag for kvantifisering ved væskekromatografi

Mengden av den målte komponenten (W) er proporsjonal med responsverdien (A) (topphøyde eller toppareal), W=f×A.

Kvantitativ korreksjonsfaktor (f): Det er proporsjonalitetskonstanten til den kvantitative beregningsformelen, og dens fysiske betydning er mengden av den målte komponenten representert av enhetens responsverdi (toppareal).

Den kvantitative korreksjonsfaktoren kan fås fra den kjente mengden standardprøve og dens responsverdi.

Mål responsverdien til den ukjente komponenten, og mengden av komponenten kan oppnås ved den kvantitative korreksjonsfaktoren.

DEL
03 Vanlige termer i kvantitativ analyse

Prøve (prøve): en løsning som inneholder en analytt for kromatografisk analyse.Delt inn i standard og ukjente prøver.

Standard: Et rent produkt med kjent konsentrasjon.Ukjent prøve (ukjent): Blandingen hvis konsentrasjon skal testes.

Prøvevekt: Den opprinnelige veiingen av prøven som skal testes.

Fortynning: Fortynningsfaktoren til den ukjente prøven.

Komponent: den kromatografiske toppen som skal analyseres kvantitativt, det vil si analytten hvis innhold er ukjent.

Mengde av komponent (mengde): innholdet (eller konsentrasjonen) av stoffet som skal testes.

Integeritet: Beregningsprosessen for å måle topparealet til en kromatografisk topp med en datamaskin.

Kalibreringskurve: En lineær kurve av komponentinnhold versus responsverdi, etablert fra en kjent mengde standardstoff, brukt til å bestemme det ukjente innholdet i analytten.

DEL
04 Kvantitativ analyse av væskekromatografi

1. Velg en kromatografisk metode som er egnet for kvantitativ analyse:

l Bekreft toppen av den oppdagede komponenten og oppnå en oppløsning (R) større enn 1,5

l Bestem konsistensen (renheten) til de kromatografiske toppene til de testede komponentene

l Bestem deteksjonsgrensen og kvantifiseringsgrensen for metoden;følsomhet og lineært område

2. Etabler en kalibreringskurve med standardprøver med forskjellige konsentrasjoner

3. Sjekk nøyaktigheten og presisjonen til kvantitative metoder

4. Bruk den tilsvarende programvaren for kromatografiadministrasjon for å implementere prøveinnsamling, databehandling og rapportere resultater

DEL
05 Identifikasjon av kvantitative topper (kvalitativ)

Identifiser kvalitativt hver kromatografisk topp som skal kvantifiseres

Bruk først standardprøven for å bestemme retensjonstiden (Rt) for den kromatografiske toppen som skal kvantifiseres.Ved å sammenligne retensjonstiden, finn komponenten som tilsvarer hver kromatografisk topp i den ukjente prøven.Den kromatografiske kvalitative metoden er å sammenligne retensjonstiden med standardprøven.Kriteriet utilstrekkeligytterligere bekreftelse (kvalitativ)

1. Standard addisjonsmetode

2. Bruk andre metoder samtidig: andre kromatografiske metoder (endre mekanismen, som: bruk av forskjellige kromatografiske kolonner), andre detektorer (PDA: spektrumsammenligning, spektrumbiblioteksøk; MS: massespektrumanalyse, spektrumbiblioteksøk)

3. Andre instrumenter og metoder

DEL
06 Bekreftelse av kvantitativ toppkonsistens

Bekreft kromatografisk toppkonsistens (renhet)

Sørg for at det kun er én målt komponent under hver kromatografisk topp

Se etter interferens fra co-eluerende stoffer (urenheter)

Metoder for bekreftelse av kromatografisk toppkonsistens (renhet)

Sammenligning av spektrogrammer med fotodiodematrisedetektorer (PDA).

Identifikasjon av topprenhet

2996 Renhetsvinkelteori

Kvantitative metoder som vanligvis brukes i DEL 07

Standard kurvemetode, delt inn i ekstern standardmetode og intern standardmetode:

1. Ekstern standardmetode: mest brukt i væskekromatografi

En serie standardprøver med kjente konsentrasjoner ble fremstilt ved bruk av rene prøver av forbindelsene som skulle testes som standardprøver.injisert i kolonnen opp til dens responsverdi (toppareal).
Innenfor et visst område er det en god lineær sammenheng mellom konsentrasjonen av standardprøven og responsverdien, nemlig W= f×A , og det lages en standardkurve.

Under nøyaktig samme eksperimentelle forhold, injiser den ukjente prøven for å oppnå responsverdien til komponenten som skal måles.I henhold til den kjente koeffisienten f kan konsentrasjonen av komponenten som skal måles oppnås.

Fordelene med den eksterne standardmetoden:enkel operasjon og beregning, det er en ofte brukt kvantitativ metode;ikke behov for at hver komponent skal detekteres og elueres;standardprøve er nødvendig;målebetingelsene for standardprøve og ukjent prøve bør være konsistente;injeksjonsvolumet skal være nøyaktig.

Ulemper med den eksterne standardmetoden:Det kreves at de eksperimentelle forholdene er høye, slik som detektorens følsomhet, strømningshastigheten og sammensetningen av den mobile fasen kan ikke endres;volumet av hver injeksjon skal ha god repeterbarhet.

2. Intern standardmetode: nøyaktig, men plagsom, mest brukt i standardmetoder

En kjent mengde av den interne standarden tilsettes standarden for å lage en blandet standard, og en serie arbeidsstandarder med kjent konsentrasjon fremstilles.Molforholdet mellom standard og intern standard i den blandede standarden forblir uendret.Injiser inn i den kromatografiske kolonnen og ta (standard prøvetoppareal/intern standard prøvetoppareal) som responsverdi.I henhold til den lineære sammenhengen mellom responsverdien og konsentrasjonen til arbeidsstandarden, nemlig W= f×A , lages en standardkurve.

En kjent mengde intern standard tilsettes den ukjente prøven og injiseres i kolonnen for å oppnå responsverdien til komponenten som skal måles.I henhold til den kjente koeffisienten f kan konsentrasjonen av komponenten som skal måles oppnås.

Egenskapene til den interne standardmetoden:Under operasjonen blandes prøven og den interne standarden sammen og injiseres i den kromatografiske kolonnen, så lenge forholdet mellom mengden av den målte komponenten og den interne standarden i den blandede løsningen er konstant, endres prøvevolumet vil ikke påvirke de kvantitative resultatene..Den interne standardmetoden oppveier påvirkningen av prøvevolumet, og til og med den mobile fasen og detektoren, så den er mer nøyaktig enn den eksterne standardmetoden.

DEL
08 Faktorer som påvirker kvantitative analyseresultater

Dårlig nøyaktighet kan være forårsaket av:

Feil integrering av toppareal, prøvedekomponering eller urenheter introdusert under prøvepreparering, prøveampulle ikke forseglet, prøve- eller løsemiddelfordampning, feil prøvepreparering, prøveinjeksjonsproblemer, feil intern standardpreparering

Mulige årsaker til dårlig presisjon:

Feil toppintegrasjon, injeksjons- eller injektorproblemer, prøvedekomponering eller urenheter introdusert under prøvepreparering, kromatografiske problemer, forringet detektorrespons