kromatografi, også kjent som "kromatografisk analyse", "kromatografi", er en separasjons- og analysemetode, som har et svært bredt spekter av bruksområder innen analytisk kjemi, organisk kjemi, biokjemi og andre felt.
Grunnleggeren av kromatografi er en russisk botaniker M.Tsvetter.I 1906 publiserte den russiske botanikeren Zvetter resultatene av sitt forsøk: For å skille plantepigmenter helte han petroleumseterekstrakt som inneholdt plantepigmenter i et glassrør som inneholdt kalsiumkarbonatpulver og eluerte det med petroleumseter fra topp til bunn.Fordi forskjellige pigmenter har forskjellig adsorpsjonskapasitet på overflaten av kalsiumkarbonatpartikler, med prosessen med utvasking, beveger forskjellige pigmenter seg ned med forskjellige hastigheter, og danner dermed bånd med forskjellige farger.Pigmentkomponentene ble separert.Han kalte denne separasjonsmetoden kromatografi.
Skjematisk representasjon av et plantebladpigmentseparasjonseksperiment
Med den kontinuerlige utviklingen av separasjonsmetoder blir flere og flere fargeløse stoffer gjenstand for separasjon, kromatografi mistet også gradvis betydningen av "farge", men navnet er fortsatt i bruk i dag.
Kromatografisk klassifisering
Essensen av kromatografi er en prosess der molekylene som skal separeres er fordelt og balansert mellom den stasjonære fasen og den mobile fasen.Ulike stoffer er fordelt forskjellig mellom de to fasene, noe som gjør at de beveger seg med ulik hastighet med den mobile fasen.Med bevegelsen av den mobile fasen skilles forskjellige komponenter i blandingen fra hverandre på den stasjonære fasen.Avhengig av mekanismen kan den deles inn i en rekke kategorier.
1, i henhold til to-fase fysisk tilstandsklassifisering
Mobil fase: Gasskromatografi, væskekromatografi, superkritisk væskekromatografi
Stasjonær fase: gass-fast, gass-væske;Væske-fast, væske-væske
2, i henhold til formen for stasjonær faseklassifisering
Kolonnekromatografi: pakket kolonnekromatografi, kapillær kolonnekromatografi, mikropakket kolonnekromatografi, preparativ kromatografi
Plankromatografi: papirkromatografi, tynnsjiktskromatografi, polymermembrankromatografi
3, klassifisert i henhold til separasjonsmekanismen
Adsorpsjonskromatografi: Ulike komponenter separeres i henhold til deres adsorpsjons- og desorpsjonskapasitet på adsorbenter
Fordelingskromatografi: De forskjellige komponentene separeres etter deres løselighet i løsningsmidlet
Molekylær eksklusjonskromatografi: i henhold til størrelsen på molekylstørrelsen til separasjonen ln ionebytterkromatografi: forskjellige komponenter av affiniteten for ionebytterharpiksseparasjonen
Affinitetskromatografi: Separasjon ved bruk av tilstedeværelsen av en spesifikk affinitet mellom biologiske makromolekyler
Kapillærelektroforese: komponentene ble separert i henhold til forskjellene i mobilitet og/eller partisjonsadferd
Kiral kromatografi brukes for separasjon og analyse av kirale legemidler, som kan deles inn i tre kategorier: kiral derivatiseringsreagensmetode;Kiral mobil fase additiv metode;Kiral stasjonær faseoppløsningsmetode
Grunnleggende terminologi for kromatografi
Kurvene som oppnås ved å plotte responssignalene til komponentene etter påvisning av kromatografisk separasjon mot tid kalles kromatogrammer.
Grunnlinje:Under visse kromatografiske forhold kalles kurven til signalet som genereres når bare den mobile fasen passerer gjennom detektorsystemet grunnlinjen, som vist i ot-linjen.Når den eksperimentelle tilstanden var stabil, var grunnlinjen en linje parallelt med den horisontale aksen.Grunnlinjen reflekterer støyen til instrumentet, hovedsakelig detektoren, over tid.
Topphøyde:den vertikale avstanden mellom det kromatografiske topppunktet og grunnlinjen, angitt med h, som vist i AB'-linjen.
Regionsbredde:Regionbredden til den kromatografiske toppen er direkte relatert til separasjonseffektiviteten.Det er tre metoder for å beskrive kromatografisk toppbredde: standardavvik σ, toppbredde W og FWHM W1/2.
Standardavvik (σ):σ er halve avstanden mellom de to infleksjonspunktene på normalfordelingskurven, og verdien av σ indikerer spredningsgraden av komponentene bort fra søylen.Jo større verdien av σ er, desto mer spredt er avløpskomponentene, og jo dårligere separasjonseffekt.Motsatt er avløpskomponentene konsentrert og separasjonseffekten er god.
Toppbredde W:Skjæringspunktene på begge sider av den kromatografiske toppen brukes som tangentlinjer, og skjæringspunktet på grunnlinjen kalles peak width, eller baseline width, som også kan uttrykkes som W, som vist i figur IJ.Etter prinsippet om normalfordeling kan forholdet mellom toppbredde og standardavvik påvises å være W=4σ.
W1/2:Toppbredden ved halve topphøyden kalles FWHM, som vist for avstanden til GH.W1/2=2,355σ, W=1,699W1/2.
W1/2, W er begge avledet fra σ og brukes til å beregne topparealer i tillegg til å måle kolonneeffekten.FWHM-måling er mer praktisk og mest brukt.
kort oppsummering
Fra den kromatografiske topputstrømningskurven kan følgende mål oppnås:
a, Kvalitativ analyse ble utført basert på retensjonsverdien til kromatografiske topper
b, kvantitativ analyse basert på arealet eller toppen av den kromatografiske toppen
C. Separasjonseffektiviteten til kolonnen ble evaluert i henhold til retensjonsverdien og toppbredden til den kromatografiske toppen
Beregningsformelen involvert i kromatografi
1. Retensjonsverdi
Retensjonsverdien er en parameter som brukes til å beskrive i hvilken grad en prøvekomponent holdes tilbake i kolonnen og brukes som en indikator for kromatografisk karakterisering.Representasjonsmetoden er som følger:
Oppbevaringstid tR
DødstidspunktettM
Juster retensjonstiden tR'=tR-tM
(Total tid brukt i stasjonær fase)
Volum av oppbevaring
VR=tR*F. (uavhengig av mobilfasehastighet)
Dødt volum
VM=tM*Fc
(Plasset som ikke er okkupert av den stasjonære fasen i strømningsbanen fra injektoren til detektoren)
Juster oppbevaringsvolumet VR'=t'R*Fc
2. Relativ oppbevaringsverdi
Relativ retensjonsverdi, også kjent som separasjonsfaktor, fordelingskoeffisientforhold eller relativ kapasitetsfaktor, er forholdet mellom den justerte retensjonstiden (volum) til den testede komponenten og den justerte retensjonstiden (volum) til standarden under visse kromatografiske forhold.
Relative retensjonsverdier ble brukt for å eliminere påvirkningen av visse driftsforhold, som strømningshastighet og fiksativ tap, på retensjonsverdier.Standarden i den relative retensjonsverdien kan være en komponent i den testede prøven eller en forbindelse tilsatt kunstig.
3. Oppbevaringsindeks
Retensjonsindeksen er retensjonsindeksen til stoffet i som skal testes i en fast løsning X. To n-alaner velges som referansestoffer, hvorav den ene har N karbontall og den andre har N+n.Deres justerte retensjonstid er henholdsvis t 'r (N) og t 'r (N+n), slik at den justerte retensjonstiden t 'r (i) for stoffet i som skal testes er nøyaktig mellom dem, dvs. t'r (N).
Retensjonsindeksen kan beregnes som følger.
4. Kapasitetsfaktor (k)
Ved likevekt er forholdet mellom massen til en komponent i den stasjonære fasen (s) og den mobile fasen (m), kalt kapasitetsfaktoren.Formelen er som følger:
5、Fordelingskoeffisient (K) I likevekt, forholdet mellom konsentrasjonen av en komponent i den stasjonære fasen(e) og den mobile fasen (m), kalt fordelingskoeffisient.Formelen er som følger
Forholdet mellom K og k:
Det gjenspeiler kolonnetypen og dens knute viktige egenskaper ved struktur
kort oppsummering
Sammenheng mellom retensjonsverdi og kapasitetsfaktor og fordelingskoeffisient:
Kromatografisk separasjon er basert på forskjellen i adsorpsjons- eller oppløsningsevnen til hver komponent i en fast relativ prøve, som kan uttrykkes kvantitativt ved størrelsen på fordelingskoeffisienten K (eller kapasitetsfaktoren k).
Komponentene med sterk adsorpsjon eller oppløsningsevne har stor fordelingskoeffisient (eller kapasitetsfaktor) og lang retensjonstid.Motsatt har komponentene med svak adsorpsjon eller løselighet en liten fordelingskoeffisient og kort retensjonstid.
Grunnleggende teori om kromatografi
1. Skuffeteori
(1) Fremsatt -- termodynamisk teori
Det startet med tårnplatemodellen foreslått av Martin og Synge.
Fraksjoneringskolonne: i brettet for flere ganger gass-væske likevekt, i henhold til kokepunktet for den forskjellige separasjonen.
Kolonne: Komponentene er balansert av flere partisjoner mellom de to fasene og separert i henhold til forskjellige partisjonskoeffisienter.
(2) Hypotese
(1) Det er mange brett i kolonnen, og komponentene kan raskt nå fordelingslikevekten innenfor brettintervallet (det vil si høyden på brettet).
(2) Den mobile fasen går inn i kolonnen, ikke kontinuerlig, men pulserende, det vil si at hver passasje er et kolonnevolum.
(3) Når prøven ble tilsatt til hver kolonneplate, kunne diffusjonen av prøven langs kolonneaksen neglisjeres.
(4) Fordelingskoeffisienten er lik på alle brett, uavhengig av mengden komponenter.Det vil si at partisjonskoeffisienten er konstant på hver taban.
(3) Prinsipp
Skjematisk diagram av brettteori
Hvis en komponent av enhetsmasse, nemlig m=1 (for eksempel 1mg eller 1μg), legges til nr. 0-brettet, og etter fordelingslikevekt, fordi k=1, nemlig ns=nm, nm=ns=0,5.
Når et platevolum (lΔV) av bæregass kommer inn i plate 0 i form av pulsering, skyves bæregassen som inneholder nm-komponenten i gassfasen til plate 1. På dette tidspunktet er ns-komponenten i væskefasen til plate 0. og nm-komponenten i gassfasen til plate 1 vil bli omfordelt mellom de to fasene.Derfor er den totale mengden komponenter inneholdt i plate 0 0,5, der gass- og væskefasene hver er 0,25, og den totale mengden inneholdt i plate 1 er også 0,5.Gass- og væskefasene var også 0,25.
Denne prosessen gjentas hver gang en ny platevolumbærergass pulseres inn i kolonnen (se tabellen nedenfor).
(4) Kromatografisk utløpskurveligning
σ er standardavviket, er retensjonstiden, C er konsentrasjonen til enhver tid,
C, er injeksjonskonsentrasjonen, det vil si den totale mengden komponenter (toppareal A).
(5) kolonneeffektivitetsparametere
Ved en konstant tR, jo mindre W eller w 1/2 (det vil si jo smalere topp), jo større antall teoretiske plater n, jo mindre er den teoretiske platehøyden, og jo høyere er separasjonseffektiviteten til kolonnen.Det samme gjelder det effektive teoribrettet neff.Derfor er det teoretiske antallet skuffer en indeks for å evaluere effektiviteten til kolonner.
(5) Egenskaper og mangler
> Fordeler
Brettteorien er semi-empirisk og forklarer formen på utløpskurven
Oppdelings- og separasjonsprosessene til komponentene er illustrert
En indeks for å evaluere effektiviteten til kolonnen er foreslått
> Begrensninger
Komponentene kan egentlig ikke nå fordelingslikevekten i de to fasene:
Langsgående diffusjon av komponenter i kolonnen kan ikke ignoreres:
Påvirkningen av ulike kinetiske faktorer på masseoverføringsprosessen ble ikke vurdert.
Forholdet mellom kolonneeffekt og strømningshastighet til mobil fase kan ikke forklares:
Det er ikke klart hvilke hovedfaktorer som påvirker kolonneeffekten
Disse problemene er tilfredsstillende løst i rateteori.
2. Taksteori
I 1956, den nederlandske lærde VanDeemter et al.absorberte konseptet brettteori, og kombinerte de kinetiske faktorene som påvirker høyden på brettet, fremmet den kinetiske teorien om kromatografisk prosess-hastighetsteori, og utledet VanDeemter-ligningen.Den betrakter den kromatografiske prosessen som en dynamisk ikke-likevektsprosess og studerer påvirkningen av kinetiske faktorer på topputvidelsen (dvs. kolonneeffekten).
Senere har Giddings og Snyder et al.foreslo væskekromatografihastighetsligningen (nemlig Giddings-ligningen) basert på VanDeemter-ligningen (senere kalt gasskromatografihastighetsligningen) og i henhold til egenskapsforskjellen mellom væske og gass.
(1) Van Deemter-ligning
Hvor: H: er høyden på brettet
A: koeffisient for virveldiffusjonsledd
B: koeffisient for molekylær diffusjonsledd
C: koeffisient for masseoverføringsmotstandsleddet
(2) Giddings-ligning
Kvantitativ og kvalitativ analyse
(1) Kvalitativ analyse
Kvalitativ kromatografisk analyse er å bestemme forbindelsene representert av hver kromatografisk topp.Siden ulike stoffer har bestemte retensjonsverdier under visse kromatografiske forhold, kan retensjonsverdien brukes som en kvalitativ indeks.Ulike kromatografiske kvalitative metoder er for tiden basert på retensjonsverdier.
Imidlertid kan forskjellige stoffer ha lignende eller identiske retensjonsverdier under de samme kromatografiske forholdene, det vil si at retensjonsverdiene ikke er eksklusive.Det er derfor vanskelig å karakterisere en helt ukjent prøve basert på retensjonsverdier alene.Hvis på grunnlag av forståelsen av kilden, arten og formålet med prøven, kan det foretas en foreløpig vurdering av sammensetningen av prøven, og følgende metoder kan brukes for å bestemme forbindelsen representert av den kromatografiske toppen.
1. Kvalitativ kontroll ved bruk av rene stoffer
Under visse kromatografiske forhold har en ukjent kun en definert retensjonstid.Derfor kan det ukjente identifiseres kvalitativt ved å sammenligne retensjonstiden til det kjente rene stoffet under samme kromatografiske forhold med retensjonstiden til det ukjente stoffet.Hvis de to er like, kan det ukjente stoffet være et kjent rent stoff;Ellers er ikke det ukjente det rene stoffet.
Den rene substanskontrollmetoden er kun anvendelig for det ukjente stoffet hvis sammensetning er kjent, hvis sammensetning er relativt enkel, og hvis rene substans er kjent.
2. Relativ retensjonsverdimetode
Den relative retensjonsverdien α, refererer til justeringen mellom komponent i og referansematerialer Forholdet mellom retensjonsverdier:
Den endres kun med endring av fiksativ og kolonnetemperatur, og har ingenting å gjøre med andre driftsforhold.
Ved en viss stasjonær fase og kolonnetemperatur måles de justerte retensjonsverdiene for henholdsvis komponent i og referansesubstans s, og beregnes deretter i henhold til formelen ovenfor.De oppnådde relative retensjonsverdiene kan kvalitativt sammenlignes med tilsvarende verdier i litteraturen.
3, tilsetning av kjente stoffer for å øke topphøydemetoden
Når det er mange komponenter i den ukjente prøven, er de oppnådde kromatografiske toppene for tette til å lett kunne identifiseres med metoden ovenfor, eller når den ukjente prøven bare brukes til den spesifiserte gjenstandsanalysen.
"Først lages et kromatogram av en ukjent prøve, og deretter et ytterligere kromatogram ved å tilsette et kjent stoff til den ukjente prøven."Komponenter med økte topphøyder kan være kjent for slike stoffer.
4. Behold den kvalitative metoden til indeksen
Retensjonsindeksen representerer retensjonsatferden til stoffer på fikseringsmidler og er for tiden den mest brukte og internasjonalt anerkjente kvalitative indeksen i GC.Den har fordelene med god reproduserbarhet, enhetlig standard og liten temperaturkoeffisient.
Retensjonsindeksen er kun relatert til egenskapene til den stasjonære fasen og kolonnetemperaturen, men ikke til andre eksperimentelle forhold.Dens nøyaktighet og reproduserbarhet er utmerket.Så lenge kolonnetemperaturen er den samme som for den stasjonære fasen, kan litteraturverdien brukes for identifikasjon, og det er ikke nødvendig å bruke det rene materialet for sammenligning.
(2) Kvantitativ analyse
Grunnlag for kromatografisk kvantifisering:
Oppgaven med kvantitativ analyse er å finne hundre av komponentene i den blandede prøven
Brøkdelinnhold.Kromatografisk kvantifisering var basert på følgende: når driftsforholdene var konsistente, var
Massen (eller konsentrasjonen) til den målte komponenten bestemmes av responssignalet gitt av detektoren
Det er proporsjonalt.Nemlig:
Grunnlag for kromatografisk kvantifisering:
Oppgaven med kvantitativ analyse er å finne hundre av komponentene i den blandede prøven
Brøkdelinnhold.Kromatografisk kvantifisering var basert på følgende: når driftsforholdene var konsistente, var
Massen (eller konsentrasjonen) til den målte komponenten bestemmes av responssignalet gitt av detektoren
Det er proporsjonalt.Nemlig:
1. Målemetode for toppareal
Toppareal er de grunnleggende kvantitative dataene gitt av kromatogrammer, og nøyaktigheten av topparealmåling påvirker direkte de kvantitative resultatene.Ulike målemetoder ble brukt for kromatografiske topper med forskjellige toppformer.
Det er vanskelig å finne den nøyaktige verdien av vinter i kvantitativ analyse:
På den ene siden på grunn av vanskeligheten med å nøyaktig måle det absolutte injeksjonsvolumet: på den andre siden
Topparealet er avhengig av de kromatografiske forholdene, og kromatografistripen bør opprettholdes når verdien måles
Det er verken mulig eller praktisk å gjøre det samme.Og selv om du kan få det riktig
Den nøyaktige verdien, også fordi det ikke er noen enhetlig standard og kan ikke brukes direkte.
2. Kvantitativ korreksjonsfaktor
Definisjon av kvantitativ korreksjonsfaktor: mengde komponenter som kommer inn i detektoren (m)
Forholdet mellom dets kromatografiske toppareal (A) eller topphøyde () er en proporsjonalitetskonstant (,
Proporsjonalitetskonstanten kalles den absolutte korreksjonsfaktoren for komponenten.
Det er vanskelig å finne den nøyaktige verdien av vinter i kvantitativ analyse:
På den ene siden på grunn av vanskeligheten med å nøyaktig måle det absolutte injeksjonsvolumet: på den andre siden
Topparealet er avhengig av de kromatografiske forholdene, og kromatografistripen bør opprettholdes når verdien måles
Det er verken mulig eller praktisk å gjøre det samme.Og selv om du kan få det riktig
Den nøyaktige verdien, også fordi det ikke er noen enhetlig standard og kan ikke brukes direkte.
Det vil si at den relative korreksjonsfaktoren til en komponent er komponenten og referansematerialet s
Forholdet mellom de absolutte korreksjonsfaktorene.
Det kan sees at den relative korreksjonsfaktoren er når kvaliteten på komponenten versus standarden.
Når stoffet s er lik, er topparealet til referansematerialet topparealet til komponenten
Flere.Hvis en komponent har masse m og toppareal A, så er antallet f'A
Verdiene er lik topparealet til referansematerialet med masse på.Med andre ord,
Gjennom den relative korreksjonsfaktoren kan topparealene til hver komponent skilles
Omregnet til topparealet til referansematerialet lik massen, deretter forholdet
Standarden er enhetlig.Så dette er den normaliserte metoden for å finne ut prosentandelen av hver komponent
Grunnlaget for mengde.
Metode for å oppnå relativ korreksjonsfaktor: relative korreksjonsfaktorverdier ble kun sammenlignet med å være
Målingen er relatert til standard og type detektor, men til operasjonsstrimmel
Det spiller ingen rolle.Derfor kan verdier hentes fra referanser i litteraturen.Hvis teksten
Hvis du ikke finner ønsket verdi i tilbudet, kan du også bestemme det selv.Metode for bestemmelse
Metode: En viss mengde av det målte stoffet ti utvalgte referansemateriale → laget til en viss konsentrasjon
De kromatografiske topparealene A og As for de to komponentene ble målt.
Det er formelen.
3. Kvantitativ beregningsmetode
(1) Areanormaliseringsmetode
Summen av innholdet av alle toppfrie fraksjoner ble beregnet til 100 % for kvantifisering
Metoden kalles normalisering.Dens beregningsformel er som følger:
Hvor P, % er prosentandelen av de testede komponentene;A1, A2... A n er komponent 1. Topparealet til 1~n;f'1, f'2... f'n er den relative korreksjonsfaktoren for komponentene 1 til n.
(2) ekstern standard metode
Metoden for kvantitativ sammenligning mellom responssignalet til komponenten som skal testes i prøven og den rene komponenten som skal testes som kontroll.
(3) Intern standardmetode
Den såkalte interne standardmetoden er en metode der en viss mengde rent stoff tilsettes standardløsningen av det testede stoffet og prøveløsningen som en intern standard, og deretter analyseres og bestemmes.
(3) standard addisjonsmetode
Standard addisjonsmetode, også kjent som intern addisjonsmetode, er å tilsette en viss mengde (△C)
Referansen til testsubstansen ble tilsatt prøveløsningen som skulle testes, og testen ble tilsatt til analysen
Toppen av prøveløsningen etter stoffet var høyere enn den opprinnelige prøveløsningen
Områdeøkningen (△A) ble brukt til å beregne konsentrasjonen av stoffet i prøveløsningen
Innhold (Cx)
Der Axe er topparealet til stoffet som skal måles i den opprinnelige prøven.
Innleggstid: 27. mars 2023